20140328藥典法新增—拉曼光譜法(三) 發(fā)布日期：2014-04-02 00:00:00 文章來源：萊雷科技
由于拉曼信號(hào)絕對(duì)強(qiáng)度的波動(dòng)，使用內(nèi)標(biāo)是最普通和有效的減少可變性的方法。內(nèi)標(biāo)方
法有幾種變通選擇。可以有目的地加入一種內(nèi)標(biāo)，該內(nèi)標(biāo)應(yīng)具有與待測(cè)物互不干擾的獨(dú)特譜
帶以便檢測(cè)。在溶液中，也可利用溶劑的獨(dú)特譜帶，因?yàn)槿軇╇S樣品不同將相對(duì)保持不變。
另外，在制劑中，如果賦形劑量大大超過待測(cè)組分，則可以使用該賦形劑的峰。在假設(shè)激光
和樣品定位的改變將會(huì)同等地影響全光譜的前提下，全光譜同樣可以用作參比。
樣品測(cè)定中需考慮的重要因素還有光譜的污染。拉曼是一種可以被許多外源影響掩蔽的
弱效應(yīng)。普通的污染源包括樣品支持物（容器或基質(zhì)）和周圍光線。通常，這些問題可以通
過細(xì)致的實(shí)驗(yàn)方法來識(shí)別和解決。
儀器裝置
根據(jù)獲得光譜的方式，拉曼光譜儀可分為FT拉曼光譜儀和色散型拉曼光譜儀，但所有
的現(xiàn)代拉曼光譜儀均包括激光光源、樣品裝置、濾光器、單色器（或干涉儀）和檢測(cè)器等。
⑴ 激光光源
表1列出幾種在藥學(xué)應(yīng)用中經(jīng)常使用的激光。紫外激光有時(shí)也有特殊應(yīng)用，但是由于種
種原因在常規(guī)分析中很少采用。
⑵ 樣品裝置
可有各種各樣的樣品放置方式，包括直接的光學(xué)界面，顯微鏡，光纖探針（不接觸或光
學(xué)浸入）和樣品室（包括特殊的樣品盛器和自動(dòng)樣品轉(zhuǎn)換器）。樣品光路也可設(shè)計(jì)成能獲得
偏振相關(guān)拉曼光譜，這種光譜通常包含附加信息。樣品裝置的選擇應(yīng)根據(jù)待測(cè)物的具體情況
（如樣品的狀態(tài)、體積等）以及測(cè)量的速度，激光的安全性和樣品圖譜的質(zhì)量要求等決定。
⑶ 濾光裝置
激光波長(zhǎng)的散射光（瑞利光）要比拉曼信號(hào)強(qiáng)幾個(gè)數(shù)量級(jí)，必須在進(jìn)入檢測(cè)器前濾除。
普遍采用的是陷波濾波器，它具有濾波效果好和體積小等優(yōu)點(diǎn)。另外，為防止樣品不被外輻
射源（如房間燈光、激光等離子體）照射，需要設(shè)置適宜的濾波器或者物理屏障。
⑷ 光波處理裝置
光波信號(hào)可通過色散或者干涉（傅里葉變換）來處理。任何合格儀器都適用于定性鑒別。
然而，選擇定量測(cè)定用儀器時(shí)，應(yīng)注意色散和線性響應(yīng)可能在整個(gè)波譜范圍內(nèi)并不均衡（例
如當(dāng)使用階梯光柵分光鏡時(shí)）。
⑸ 檢測(cè)器
硅質(zhì)CCD是色散儀器中最常用的檢測(cè)器。這種冷卻的陣列檢測(cè)器允許在低噪聲下快速
全光譜掃描，常與通常使用的785納米二極管激光器配合使用。傅里葉變換儀器通常采用單
通道鍺或銦－鎵－砷化合物(InGaAs)檢測(cè)器以配合釹：釔－鋁－石榴紅(Nd:YAG)1064納米
的激光器在近紅區(qū)使用。
儀器校正
拉曼儀器的校準(zhǔn)包括三個(gè)要素：初始波長(zhǎng)（X軸）、激光波長(zhǎng)以及強(qiáng)度（Y軸）。
儀器供應(yīng)商應(yīng)提供可由用戶可以執(zhí)行的對(duì)儀器相關(guān)參數(shù)校準(zhǔn)的方法。除另有規(guī)定外，使
用者應(yīng)根據(jù)儀器所提供的校準(zhǔn)方法制定具體的SOP，并嚴(yán)格按照SOP對(duì)上述參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。
特別需要注意的是，激光波長(zhǎng)變化可影響儀器的波長(zhǎng)精度和光度（強(qiáng)度）精度。即使是
最穩(wěn)定的激光器，在使用過程中其輸出波長(zhǎng)也會(huì)有輕微變化。所以，激光波長(zhǎng)必須經(jīng)校正以
確保拉曼位移的準(zhǔn)確性?？梢允褂脙x器供應(yīng)商提供的拉曼位移標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)進(jìn)行定期校正。
某些儀器可以用一種拉曼內(nèi)標(biāo)物與初級(jí)光路分離，外在校準(zhǔn)裝置通過散射輻射準(zhǔn)確地重現(xiàn)這
一光路。
推薦使用外部參考標(biāo)準(zhǔn)對(duì)儀器進(jìn)行校正。
方法驗(yàn)證
必須對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證，至少應(yīng)考察準(zhǔn)確度、精密度等主要指標(biāo)。但這些指標(biāo)受諸多可變
因素的影響，其中熒光可能是影響方法適用性的主要因素。樣品中熒光雜質(zhì)的存在完全隨樣
品而異。所以，方法必須能適應(yīng)不同的樣品體系，必須足以將雜質(zhì)的影響降到最小。
檢測(cè)器的線性必須適應(yīng)可能的信號(hào)水平范圍。熒光可能使信號(hào)基線比驗(yàn)證時(shí)高，這時(shí)必須設(shè)法將熒光減弱或者使驗(yàn)證的方法適應(yīng)較高的熒光水平。這一要求對(duì)方法的精密度，檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）同樣適用，因?yàn)榛€噪聲的增加會(huì)對(duì)這些數(shù)值產(chǎn)生影響。由于熒光使基線漂移可能同樣會(huì)影響定量，所以使用時(shí)，同樣需要在不同的光漂白作用水平進(jìn)行可接受的定量驗(yàn)證。
必須確定激光是否對(duì)樣品造成影響。在不同激光功率和暴露時(shí)間的條件下，對(duì)樣品目視
檢查和仔細(xì)審視測(cè)得的拉曼光譜可以確定樣品是否改變（而不是光漂白作用）。觀察的依據(jù)
是譜帶位置、峰強(qiáng)和譜帶寬度是否改變或者背景強(qiáng)度是否有明顯變化。
影響方法精密度的因素還包括樣品的位置和固體、液體樣品的形態(tài)，在校正模型中必須
嚴(yán)密控制或說明。樣品的制備方法或樣品試架的形狀可能影響測(cè)量靈敏度，而且，該靈敏度
會(huì)隨著儀器的激發(fā)光和采集光學(xué)設(shè)置的不同而不同。
測(cè)定法
測(cè)定拉曼光譜可以采用以下任一物質(zhì)態(tài)：結(jié)晶態(tài)、無(wú)定型、液體、氣體或等離子體。
液體能夠在玻璃管或石英管中直接測(cè)量。無(wú)定型和微晶固體也可充填入玻璃管或石英管中直接測(cè)定。為了獲得較大的拉曼散射光強(qiáng)度，通常使照射在樣品上的入射光與所檢測(cè)的拉曼散射光之間的夾角為0o，90o和180o。樣品池的放置可有多種方式。
除另有規(guī)定外，一般用作鑒別的樣品不必制樣，用作晶型、異構(gòu)體限度檢查或含量測(cè)定
時(shí)，供試品的制備和具體測(cè)定方法可按正文中各品種項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定操作。
某些特殊樣品技術(shù)可被應(yīng)用于表面增強(qiáng)拉曼光譜和顯微拉曼光譜測(cè)量。
為防止樣品分解，常采用的辦法是旋轉(zhuǎn)技術(shù)。利用特殊的裝置使激光光束的焦點(diǎn)和樣品
的表面做相對(duì)運(yùn)動(dòng)，從而避免了樣品的局部過熱現(xiàn)象。樣品旋轉(zhuǎn)技術(shù)除能防止樣品分解外，
還能提高分析的靈敏度。
常采用內(nèi)標(biāo)法定量，在激光照射下，加入的內(nèi)標(biāo)也產(chǎn)生拉曼光譜，選擇其一條拉曼譜帶
作為標(biāo)準(zhǔn)，將樣品的拉曼譜帶強(qiáng)度與內(nèi)標(biāo)譜帶的強(qiáng)度進(jìn)行比較(通常比較譜帶的面積或高
度)。由于內(nèi)標(biāo)和樣品完全處于相同的實(shí)驗(yàn)條件下，一些影響因素可以相互抵消。
所選擇的內(nèi)標(biāo)應(yīng)滿足以下要求：
①化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，不與樣品中被測(cè)成分或其它成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)， ②內(nèi)標(biāo)拉曼譜
帶和待測(cè)物的拉曼譜帶互不干擾， ③內(nèi)標(biāo)應(yīng)比較純，不含有被測(cè)成分或其他干擾成分。對(duì)
于非水溶液，常用的內(nèi)標(biāo)為四氯化碳(11475px-1)；而對(duì)于水溶液，常用的內(nèi)標(biāo)是硝酸根離子
(26250px-1)和高氯酸根離子。對(duì)于固體樣品，有時(shí)選擇樣品中某一拉曼譜帶作為自身對(duì)照內(nèi)
標(biāo)譜帶。
具有多晶現(xiàn)象的固體藥品，由于晶型不同，可能導(dǎo)致所收集的供試品光譜圖與對(duì)照品光譜圖或標(biāo)準(zhǔn)光譜集所收載的光譜圖不一致，遇此情況，應(yīng)按該品種項(xiàng)下規(guī)定的方法進(jìn)行預(yù)處
理后再繪制比對(duì)。
光譜的形狀與所用的儀器型號(hào)和性能、激發(fā)波長(zhǎng)、樣品測(cè)定狀態(tài)及吸水程度等因素相關(guān)。
因此，進(jìn)行光譜比對(duì)時(shí)，應(yīng)考慮各種因素可能造成的影響。
起草單位：江蘇省食品藥品檢驗(yàn)所
審校：江蘇省食品藥品檢驗(yàn)所 王玉
復(fù)審：中國(guó)藥科大學(xué) 張尊建
